2、BCL2、Caspase-3实验技巧解析
BCL2
BCL-2家族蛋白参与一系列内源性凋亡调控机制，通过控制线粒体外膜的通透性调控细胞死亡。BCL2属于抗凋亡蛋白。BCL-2 可以通过阻断BH3-only蛋白与其激活剂和增敏剂的结合来阻滞凋亡程序[3]。
组织表达特异性：广泛存在，在恶性肿瘤中高度表达。
分子量：26 kDa，22 kDa（易形成同源二聚体或异源二聚体）。
亚细胞定位：主要定位在线粒体外膜，在内质网和核膜也有表达[4]。
BCL2检测Tips：
1. BCL2是线粒体膜蛋白，在某些组织和细胞类型中表达水平较低，需要优化实验方法和条件，提高抗体特异性。
2. BCL2蛋白分子量偏小，推荐使用高浓度（15~20%）的SDS-PAGE凝胶和0.22μm的PVDF膜，适当降低电泳电压（80-120V），提高分离效果，蛋白条带更清晰。
3. BCL2有2个异构体，22 kDa和26 kDa，易形成同源二聚体或异源二聚体，蛋白变性不充分可能会检测到聚合体形式的条带。
4. BCL2蛋白会发生各种翻译后修饰，如磷酸化、泛素化和乙酰化等，从而影响其抗凋亡功能。抗体与磷酸化BCL2和未磷酸化BCL的结合能力也可能不同，所以可用磷酸化抗体（80771-2-RR）检测BCL2是否存发生磷酸化修饰。
使用BCL2抗体（12789-1-AP）的WB、IHC和IF检测图
Caspase-3
Caspase-3是一种半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起着关键的执行者作用。它通过识别特定的底物序列，如Asp-Glu-Val-Asp（DEVD），来切割多种细胞蛋白，导致细胞的形态学变化，如染色质凝聚和DNA片段化。在凋亡刺激下，起始caspase（如caspase-9）会切割procaspase-3的结构域间连接链，引发构象变化，暴露其活性位点（C163），从而激活Caspase3[5]。
组织表达特异性：Caspase-3在多种组织中均有表达，尤其在神经系统、免疫系统和上皮组织中表达较高。在正常生理状态下，Caspase-3以前体形式存在，只有在受到凋亡刺激时才会被激活。
分子量：Caspase-3的前体蛋白（procaspase-3）的分子量约为32 kDa，被激活时，会被切割成P19（19 kDa）和P17（17 kDa）片段[6]。
亚细胞定位：定位在细胞质中，当凋亡发生时，转移至细胞核。
Caspase-3检测Tips：
1. Caspase-3在细胞内通常以无活性的前体（Procaspase 32 kDa）存在，凋亡时天冬氨酸残基处发生蛋白水解，生成19 kDa的中间产物、17 kDa和12 kDa的剪切体，这些片段也这种切割过程会导致 Caspase-3 在western blot检测时出现多个条带。
2. Caspase-3凋亡过程一般需要刺激活化（如星形孢菌素处理），但也可能存在自发凋亡，检测难度偏高。通常需要设置未处理的对照组校正实验数据。
3. 活化后的Caspase-3成熟体之间可能会形成复合体，在WB中的分子量与前体分子量接近，需要根据实际结果与未处理的对照组之间的差异进行判断。
4. Caspase-3蛋白被激活后易被快速降解，需要添加蛋白酶抑制剂，在冰上迅速处理样本，并且将裂解后的样本冻存于-80℃，避免反复冻融。
5. Caspase-3剪切体分子量偏小，需要优化实验条件，调整电泳和转膜时间。
使用Caspase 3抗体的WB（82202-1-RR）、IF和IHC（19677-1-AP）检测图
3、细胞凋亡相关抗体推荐
细胞凋亡是程序性细胞死亡的重要形式，主要由Caspase家族蛋白酶（如Caspase-3/8/9）级联激活执行。内源性途径中，Bcl-2家族（促凋亡Bax/Bak vs 抗凋亡Bcl-2/Bcl-xL）调控线粒体外膜通透性，释放细胞色素C形成凋亡小体；外源性途径则通过Fas/TNFR1激活下游信号。Proteintech可提供高品质抗体及相关产品，助力凋亡机制研究。
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Chapter2 细胞自噬
1、什么是细胞自噬？
细胞自噬（Autophagy）是细胞通过溶酶体途径降解自身异常组分（如受损蛋白、细胞器或病原体）并回收利用的保守过程。当细胞发生自噬时，由于胞内成分被降解，细胞体积缩小，染色质呈现边缘化凝聚（但不同于凋亡的核碎裂）；电镜下可见特征性的双层膜自噬体结构包裹待降解物质；同时溶酶体数量及活性明显增加，表现为酸性磷酸酶等水解酶活性升高[7~9]。细胞自噬与多种疾病的发生发展密切相关，早期通过清除受损细胞器和异常蛋白发挥抑癌效应，而晚期则通过提供营养和能量促进肿瘤细胞存活[10]。
在应激（如饥饿、缺氧或损伤）条件下，细胞通过激活自噬相关基因（autophagy-related gene, ATG），首先形成双层膜结构的吞噬泡（phagophore），随后扩展包裹待降解的底物（如受损蛋白或细胞器）形成自噬体（autophagosome），接着自噬体沿微管运输并与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），最终内容物被溶酶体酶降解并回收利用，从而维持细胞稳态[11~12]。
图2 细胞自噬途径
2、LC3、p62实验技巧解析
LC3
LC3（微管相关蛋白1A/1B轻链3）是自噬过程的核心标志物，属于Atg8蛋白家族，在自噬体的形成、延伸及底物降解中发挥关键作用。在自噬过程中，自噬体包裹胞质成分（包括可溶性蛋白和细胞器），同时胞浆型LC3（LC3-I）与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-磷脂酰乙醇胺结合物（LC3-II），后者被募集至自噬体膜上。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，其内容物被溶酶体水解酶降解，此时自噬溶酶体腔内的LC3-II也随之降解[10]。
其脂化形式（LC3-II）被广泛用作自噬活性的检测指标，通过免疫印迹或免疫荧光检测LC3已成为监测自噬及其相关过程（包括自噬性细胞死亡）的可靠方法。
组织表达特异性：广泛表达于几乎所有类型的组织和细胞中。
分子量：LC3-I：~16-18 kDa（未修饰，胞浆可溶）; LC3-II：~14-16 kDa（PE修饰，膜结合，自噬体标志）。
亚细胞定位：可溶性LC3-I定位于细胞质，膜结合LC3-II（自噬体相关型）为点状聚集（自噬体）信号。
LC3检测Tips：
1. 样本处理关键点
（1）样本制备时使用含蛋白酶抑制剂的裂解液，防止LC3-II降解；
（2）避免反复冻融，建议新鲜裂解样本；
2. WB优化
（1）LC3-I和LC3-II是小分子蛋白，建议使用高浓度分离胶（12%～15%）进行分离；
（2）推荐使用0.22um转印膜转膜；
3. 定量方法选择
在分析自噬标志物LC3时，科学家除了采用LC3-II/LC3-I比值，还会使用LC3-II与管家蛋白（如β-actin、GAPDH等）的比值。
对于高自噬活性样本，优先用LC3-II/管家蛋白（如β-actin），避免LC3-I耗尽导致比值失真；对于机制研究评估反映LC3转化过程，可优先用LC3-II/LC3-I比值。
4. 实验验证
（1）由于细胞类型、生理状态、自噬基础水平以及实验处理条件的不同，LC3-I和LC3-II的比例在不同样本中可能存在显著差异；
（2）建议实验设立对照组，例如基础组（未处理）、自噬诱导组（如饥饿、雷帕霉素(Rapamycin)）和自噬抑制组（如巴佛洛霉素A1 (Bafilomycin A1)、氯喹(Chloroquine)），来观察自噬的变化水平。
使用LC3抗体的WB（81004-1-RR）和IF（14600-1-AP）检测图
p62/SQSTM1
p62（又称Sequestosome 1，SQSTM1）是一种自噬受体蛋白，能够将错误折叠的蛋白质转运至自噬-溶酶体系统进行降解。p62通过结合泛素化蛋白聚集体，介导这些蛋白在自噬后期定位于自噬体并被降解[11]。一般认为，p62的表达水平与自噬活性呈负相关。
组织表达特异性：广泛表达于几乎所有类型的组织和细胞中。
分子量：62 kDa。
亚细胞定位：主要位于细胞质。
自噬激活（如饥饿）：点状结构短暂增多（底物募集），随后减少（降解）。
自噬抑制（如Chloroquine，CQ）：点状结构持续增多、增大（降解阻断）。
p62/SQSTM1检测Tips：
1. 样本制备时使用含蛋白酶抑制剂的裂解液，防止p62/SQSTM1蛋白的降解；
2. p62/SQSTM1蛋白易聚集或降解，建议使用新鲜组织/细胞样本，避免多次冻融；
3. 建议使用10-12% SDS-PAGE胶，延长电泳时间以确保p62/SQSTM1与邻近条带分离
4. 蛋白可能发生磷酸化、泛素化等修饰，实际检测条带可能与预测值（理论约62kDa）不符;
5. 在不同组织或细胞类型中p62/SQSTM1蛋白的基础表达量可能存在差异；
6. 建议实验设立对照组，例如基础组（未处理）、自噬诱导组[如饥饿、雷帕霉素(Rapamycin)]和自噬抑制组[如巴佛洛霉素A1 (Bafilomycin A1)、氯喹(Chloroquine)]，来观察自噬的变化水平。
使用p62抗体的WB（84826-1-RR）和IF（18420-1-AP）检测图
3、自噬相关抗体推荐
自噬是细胞通过形成自噬小体降解受损细胞器的关键过程。LC3（自噬标志物）与p62（选择性自噬接头蛋白）参与底物识别，ATG5-ATG12复合物结合ATG16L1生成自噬延伸复合物从而调控LC3的脂化。Beclin 1与VPS34、ATG14等组成复合物，调控自噬起始阶段的吞噬泡形成，Beclin 1也是自噬与肿瘤研究的关键靶标。Proteintech提供高品质自噬抗体，覆盖上述关键靶标，助力自噬机制研究。
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另外，为了满足不同研究需求，我们还提供以下两种自噬检测抗体组合套装：Autophagy Essentials Antibody Kit (PK30004)和Autophagy Expanded Antibody Kit (PK30005)。对于开始新项目的研究人员、筛选多个潜在目标的研究人员或那些仅仅需要较少体积抗体的研究人员来说是非常适合的！
Chapter3 细胞坏死
1、什么是细胞坏死？
细胞坏死（Necrosis）是一种由极端的物理化学因素或外部损伤（如缺氧、缺血、感染）引发并伴随强烈的炎症反应、被动的、非程序性细胞死亡形式。细胞坏死表现为细胞结构破坏，细胞膜破裂，染色质不发生凝集，随机降解，细胞器变形或肿胀。细胞内容物泄漏到周围环境，释放损伤相关分子模式（DAMPs），如HMGB1、IL-1β等，引发炎症反应。线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放导致线粒体膜电位丧失、ATP生成停止、线粒体肿胀和外膜破裂，最终引发细胞坏死。
细胞坏死的主要特点是细胞结构的破坏和内容物的无序释放，不形成坏死小体（区别于坏死性凋亡）或凋亡小体（区别于凋亡），通常会引起强烈的炎症反应，导致周围组织进一步损伤[13]。
图3 凋亡与坏死
2、HMGB1、LDHA实验技巧解析
HMGB1
HMGB1是一种非组蛋白核蛋白，主要参与染色质结构维持、基因转录调控、DNA修复和复制等过程。在细胞应激或坏死时，HMGB1被主动分泌或被动释放到胞外，转化为促炎性损伤相关分子模式（DAMP），通过结合RAGE、TLR2/4/9等受体激活NF-κB、MAPK等信号通路，促进炎症反应和免疫细胞募集[14]。
组织表达特异性：广泛表达于各种组织中。
分子量：25 kDa。
亚细胞定位：主要位于细胞核，但在应激条件下可转移到细胞质和细胞外。
HMGB1检测Tips：
1. 正常生理状态下，HMGB1主要定位在细胞核，参与DNA修复和染色质稳定，因此需严格按照核蛋白提取方法，选择合适的裂解缓冲液和裂解时间，在冰上用超声破碎法破碎细胞核。
2. 如果在进行核质分离检测实验，建议先用物理或化学方法选择性裂解细胞膜和细胞质，保留完整细胞核，再裂解核膜释放核内蛋白。避免细胞质蛋白与核蛋白交叉污染。
3. HMGB1蛋白主要以25 kDa 形式存在，但也会和其他分子形成150 kDa~250 kDa的高分子量复合物，降低抗体对蛋白的结合亲和力，影响实验结果。
4. HMGB1在应激条件下会从细胞核转移到胞质和胞外环境中，并发生乙酰化的翻译后修饰，改变蛋白的结构和性质。
使用HMGB1抗体（82973-1-RR）的WB和IF检测图
LDHA
LDHA是一种催化丙酮酸和NADH转化为乳酸和NAD+的酶，在调节糖酵解过程中起着关键作用。癌细胞通常会上调LDHA，从而促进其代谢转换为有氧糖酵解，并生成乳酸。一些研究表明，LDHA在肿瘤进展中起着重要作用[15]。
组织表达特异性：主要在骨骼肌和肝脏等厌氧组织中表达。
分子量：32-37 kDa。
亚细胞定位：位于细胞质。
LDHA检测Tips:
1. LDHA存在多种形式的异构体，分子量为 27-40 kDa，在不同组织和细胞中的表达水平差异较大，可形成同源四聚体。因此检测情况较为复杂，可以使用敲除LDHA的细胞系作为阴性对照，确定实验结果。
2. LDHA、LDHB、LDHC是乳酸脱氢酶的三种同工酶，具有一定的相似性。LDHA在糖酵解组织如骨骼肌、心肌和肝中表达，LDHB在氧化组织中表达，LDHC在睾丸的生殖细胞中表达。建议选用LDHA特异性抗体（货号：19987-1-AP）进行实验。
3. 在进行免疫组织化学（IHC）实验时，为避免样本制备过程中LDHA蛋白表位被掩盖，需要使用TE缓冲液（pH 9.0）或柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复，有助于暴露表位，提高抗体结合能力。
使用LDHA抗体（19987-1-AP）的WB和IF检测图
3、坏死相关抗体推荐
细胞坏死是一种Caspase非依赖性的、受调控的细胞死亡形式，由受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RIPs）和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）的激活驱动。坏死进程为正常细胞经过细胞肿胀，细胞膜分解，至细胞内容物释放，如HMGB1等，引发炎症反应至细胞坏死。Proteintech可提供高品质抗体及相关产品，助力坏死机制研究。
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Chapter4 坏死性凋亡
1、什么是坏死性凋亡？
坏死性凋亡（Necroptosis）是一种程序性细胞死亡方式，兼具细胞凋亡和坏死的特征。它是由细胞内一系列信号通路介导，最终导致细胞死亡的过程，在维持组织稳态、清除感染细胞以及调节免疫反应等方面发挥重要作用。坏死性凋亡主要通过TNF信号通路发生，TNF-α与其受体结合后，可激活一系列下游信号通路，包括RIPK1和RIPK3的激活。RIPK1和RIPK3的相互作用形成坏死小体（Necrosome），进而激活MLKL（Mixed Lineage Kinase Domain-like）。激活的MLKL在细胞膜上形成孔洞，导致细胞内容物外泄，最终引发细胞坏死。坏死性凋亡可引发适度的炎症反应，有助于清除死亡细胞和修复组织[16-18]。
图4 Model for necroptosis induction by TNF [18]
2、RIPK3、MLKL实验技巧解析
RIPK3
RIPK3也是坏死性凋亡的关键调控因子，通过其激酶活性，将上游的细胞应激信号（如TNF-α刺激）转化为下游的细胞死亡信号（如MLKL的激活）。当caspase-8被抑制时，RIPK1与RIPK3通过受体结合蛋白同型相互作用基序（RHIM）相互作用，形成坏死小体，触发坏死性凋亡[21]。
组织表达特异性：在胰腺中高度表达。在心脏、胎盘、肺和肾中的检测水平较低。
分子量：57-70 kDa。
亚细胞定位：主要位于细胞质，也存在于细胞核。
RIPK3检测Tips：
1. WB检测时需使用新鲜样本检测RIPK3，以防发生蛋白降解。
2. RIPK3的S227位点磷酸化可能会改变抗体识别的表位结构，影响抗体结合。检测磷酸化RIPK3时，待测样本中需添加磷酸酶抑制剂进行处理。
3. 人和小鼠的RIPK3序列同源性不高，需要用物种特异性的抗体检测，避免出现人RIPK3的抗体无法识别小鼠RIPK3的情况。
使用RIPK3抗体（17563-1-AP）的WB、IHC和IF检测图
MLKL
MLKL属于蛋白激酶超家族，通过与RIPK3相互作用，在坏死性凋亡过程中发挥其功能[18]。MLKL的激活不仅需要RIPK3依赖的磷酸化，还要与高度磷酸化的肌醇磷酸结合。
组织表达特异性：组织特异性低。
分子量：35-40 kDa，50-55 kDa。
亚细胞定位：定位于细胞质，在发生坏死性凋亡时异位至细胞膜。当响应正粘病毒感染时定位于细胞核。
MLKL检测Tips:
1. MLKL分子量除了50-55kDa的MLKL单体和35-40 kDa异构体，还易产生216 kDa的四聚体。
2. MLKL存在磷酸化位点，需用磷酸化抗体（货号：82090-2-RR）检测磷酸化形式。
3. 检测磷酸化MLKL时，待测样本中需添加磷酸酶抑制剂进行处理。
4. MLKL的种属同源性不高，需要用物种特异性的抗体检测。
5. 阳性对照：
MLKL：HT-29 cells、HeLa cells、HepG2 cells。
p-MLKL：TNF alpha（20 ng/mL，0.5h）和 Calyculin A（100 nM，0.5h）处理的HT-29 cells。
使用MLKL抗体（66675-1-lg）的WB和IF检测图
3、坏死性凋亡相关抗体推荐
坏死性凋亡主要在于RIP1-RIP3-MLKL通路的磷酸化。RIPK1和RIPK3的相互作用形成坏死小体，进而激活MLKL。磷酸化MLKL转移到细胞膜，导致细胞内容物外泄，最终引发细胞坏死。Proteintech可提供高品质抗体及相关产品，助力坏死性凋亡机制研究。
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Chapter5 铁死亡
1、什么是铁死亡？
铁死亡（Ferroptosis）是一种依赖于铁离子和脂质过氧化的程序性细胞死亡形式，与传统的细胞死亡方式如凋亡、坏死和自噬有显著不同。铁死亡的特征在于细胞内铁离子的异常积累引发脂质过氧化，导致细胞膜结构和功能的损伤，最终引起细胞死亡。铁死亡的发现为多种疾病的研究提供了新的视角，尤其是与癌症、神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病）和缺血再灌注损伤等疾病密切相关[22-24]。
图5 铁死亡途径
2、GPX4、SLC7A11/xCT、DHODH实验技巧解析
GPX4
GPX4（Glutathione peroxidase 4）是最重要的抗氧化酶之一，也是铁死亡的关键调控因子。它通过保守的催化三联体硒代半胱氨酸46、天冬酰胺81和色氨酸136直接还原磷脂氢过氧化物。GPX4的反应动力学被描 述为乒乓模式 ， 体现在两个阶段。首先，过氧化物通过活性位点硒代半胱氨酸46还原，然后转化为氧化形式。第二阶段是通过谷胱甘肽补充氧化催化位点。谷胱甘肽（GSH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的含量直接影响GPX4活性。
组织表达特异性：广泛表达于多种组织和细胞中，主要存在于睾丸组织中。
分子量：20-23 kDa（存在两种异构体，分别约为20KDa和22KDa）
亚细胞定位：主要位于胞浆，负责还原胞浆中的脂质过氧化物
GPX4检测Tips:
1. GPX4对氧化敏感，裂解液中需加入还原剂（如1-5 mM DTT或β-巯基乙醇）；
2. GPX4存在两种异构体，分别约为20KDa和22KDa，需确认抗体特异性，可以用GPX4敲除细胞作为阴性对照；
3. 诱导铁死亡，如用Erastin或RSL3时，GPX4蛋白水平可能下降，需同步检测脂质过氧化物，如MDA或4-HNE来验证表型；
4. GPX4主要在睾丸中表达；其在不同的组织和细胞中表达差异显著，实验时需要根据表达丰度进行调整。
使用GPX4抗体（67763-1-lg）的WB和IF检测图
SLC7A11/xCT
SLC7A11是一种多通道跨膜蛋白，介导Xc- system中的胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白活性。目前，对Xc- system的研究重点在SLC7A11。大量研究表明，SLC7A11介导的胱氨酸摄取在抑制氧化应激条件下的铁死亡和维持细胞存活方面的关键作用。
组织表达特异性：在 脑、肝脏、免疫细胞以及肿瘤中高表达。
分子量：35-40 kDa
亚细胞定位：作为转运体，主要定位于质膜上
SLC7A11检测Tips:
1. SLC7A11/xCT易降解，建议新鲜样本或液氮速冻；
2. 在样本处理时，避免反复冻融，防止蛋白降解；
3. SLC7A11/xCT的分子量在35-40 kDa，与GAPDH (36 kDa)分子量接近；注意实验时，选择合适的内参；
4. SLC7A11/xCT是跨膜转运蛋白，建议用不煮的样品进行WB实验。
使用SLC7A11/xCT抗体（26864-1-AP）的WB和IHC检测图
DHODH
二氢乳清酸脱氢酶(DHODH, dihydroorotate dehydrogenase)被确定为一种线粒体铁死亡抑制剂，其通过减少线粒体CoQ10发挥作用，类似于线粒体外膜中FSP1的功能。
组织表达特异性：DHODH是一种线粒体酶，在肝脏、脾脏和淋巴组织，以及免疫细胞、肿瘤细胞中高表达。
分子量：43 kDa
亚细胞定位：位于线粒体内膜
DHODH检测Tips：
1. DHODH的分子量在43 kDa，与Beta Actin (42 kDa)分子量接近；注意实验时，选择合适的内参；
2. DHODH主要位于线粒体，需确保裂解充分，可以进行超声处理；
3. 线粒体蛋白对温度较为敏感，高温可能会导致蛋白聚集或降解，这一类蛋白可能不适合煮样；在实验时可以考虑采用37℃放置10-30 min的方法进行处理。
使用DHODH抗体（14877-1-AP）的WB和IF检测图
3、铁死亡相关抗体推荐
铁死亡是一种由铁依赖的脂质过氧化诱导的调节性细胞死亡形式，铁积累引发Fenton反应，导致脂质ROS堆积，同时GPX4失活或SLC7A11转运体抑制导致抗氧化防御失效，最终引发铁死亡。ACSL4和LPCAT3是参与脂质过氧化物形成的两种关键酶。胱氨酸-GSH-GPX4、CoQ10-FSP1、GCH1-BH4-DHFR三大系统能有效抑制脂质过氧化，从而抵御铁死亡。Proteintech可提供高品质抗体及相关产品，助力铁死亡机制研究。
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另外，为了满足不同研究需求，我们还提供以下两种铁死亡抗体组合套装：Ferroptosis Essentials Antibody Kit (PK30002)和Ferroptosis Expanded Antibody Kit (PK30003)。对于开始新项目的研究人员、筛选多个潜在目标的研究人员或那些仅仅需要较少体积抗体的研究人员来说是非常适合的！
下期预告：我们将继续解析焦亡、铜死亡、双硫死亡、失巢凋亡和泛凋亡的死亡方式及关键靶点检测技巧。欢迎持续关注，下期见~
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